漂泊

豬乳鐵蛋白之純化與功能性評估


李定宇


乳鐵蛋白是一個78-80 kDa之糖蛋白，主要分佈於哺乳動物之體液中，包括母乳、唾液、眼淚及黏膜分泌液，亦可由發炎反應中活化之嗜中性白血球所釋放。乳鐵蛋白不但具有廣泛的抑菌效果，還可以促進一些免疫細胞之增生，更有抑制癌細胞增生的能力。一般認為乳鐵蛋白可以使嬰兒提高對腸胃感染之抗性及增強免疫力，故添加在牛奶中供嬰兒食用。


乳鐵蛋白所存在之抑菌機制主要有兩種:乳鐵蛋白是一種鐵離子結合性蛋白，乳鐵蛋白會限制自由態鐵離子的量，因鐵離子是微生物之必須生長因子，故可限制微生物之生長。另外乳鐵蛋白可以破壞革蘭氏陰性菌之細胞外膜，使細胞膜的通透性改變，而達到抑菌效果。而且以胃蛋白酉每水解所產生的蛋白質N端片段，具有比完整的乳鐵蛋白更強之殺菌能力；此段功能性片段稱為Lactoferricin。


Lactoferricin會形成一種扭曲的β-sheet結構，擁有一段約七個月安基酸的疏水性序列，還有許多親水性及帶正電的序列環繞在疏水性附近，使Lactoferricin具有兩性的特性，此特性可以幫助Lactoferricin與生物膜之作用。在完整的乳鐵蛋白中，Trp22及Met26會與Ala274,Phe278,Phe286,Leu288及Leu299互動，將Trp22及Met26包在內部的區域。這些疏水性的互動可能可以促進完整的乳鐵蛋白形成α-helix，而Lactoferricin之β-sheet結構似乎比完整乳鐵蛋白之α-helix結構對於細胞膜具有更好之作用。


本實驗室學長參考了pET31b 之眾列月生月太表現系統，先在引子上設計BstEII之限制酉每切位，以聚合媒鏈鎖反應找到想要的Lactoferricin DNA片段，以限制酉每切下，再將其接成重覆性序列；先接至pUCT上，再分別次選殖入pET expression vector-pET30b,pET32b上，送入Novablue(DE3)中表現蛋白質，而我在嘗試各種表現條件之後，於SDS-PAGE中可以發現分別約在30及40 kDa的位置發現有蛋白質表現；所以希望以His-tag的方式將其純化，進而進行MIC等抑菌測試。


因為鐵離子在微生物生理調節中扮演重要的角色，因此乳鐵蛋白會與微生物共同競爭鐵離子以達到抑菌的功能。然而，目前已發現微生物會在細胞膜上產生乳鐵蛋白之結合蛋白(Lactoferrin binding protein)，此結合蛋白會利用與乳鐵蛋白之專一性結合，以提供細菌鐵離子的來源；因此本實驗將使用reverse genetics的方式，嘗試去尋找細菌上豬乳鐵蛋白的結合蛋白及在搶鐵作用中之功用蛋白，以幫助去了解豬乳鐵蛋白與細菌之間的相互作用(包括Klebsiella, Pseudomonas)。另外我們希望進一步去了解乳鐵蛋白N端抗菌部份以外之功能性區域在免疫調節上所具有之功能，並希望可以藉此了解乳鐵蛋白在細菌致病機制及免疫調節中所扮演的角色。